甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)试剂盒

基于抗体富集甲基化DNA

 

MeDIP试剂盒简介

MeDIP试剂盒采用免疫沉淀的方法富集甲基化的单链DNA片段。试剂盒包含甲基化胞嘧啶特异性单抗,桥连抗体,以及甲基化DNA免疫沉淀实验中需要用到的缓冲液。抗体的高特异性及亲和力可以确保从包含羟甲基化及其他DNA甲基化变体的单链DNA样本中分离甲基化片段。

MeDIP试剂盒选用磁珠,实现简单快速的操作流程。减少实验中清洗及孵育步骤,为研究者节省宝贵时间。试剂盒还包含MseI酶切的人类基因组DNA及PCR引物作为阳性对照,验证实验组的富集效率。另外,试剂盒中的磁条可以为沉淀和富集后的甲基化DNA分离和洗脱提供便利。

5-甲基化(5-mC)DNA免疫沉淀

甲基化DNA免疫沉淀基于免疫捕获技术,使用甲基化胞嘧啶的特异性抗体免疫沉淀基因组中富集甲基化DNA的片段。MeDIP适用于超声或酶切片段化处理后的单链DNA样本。5-mC甲基化单抗协同桥连抗体共同实现富含5-mC甲基化DNA片段的特异性获取。Protein G磁珠的使用可实现快速有效的捕获,沉淀后从磁珠洗脱即可获得特异性的5-mC甲基化DNA样本。这种特异性选择至关重要,因为绝大多数DNA甲基化的分析方法如酶切及重亚硫酸盐转化等都无法实现区分5-甲基化胞嘧啶(5-mC)和5-羟甲基化胞嘧啶(5-hmC)。

MeDIP试剂盒中高亲和力的5-mC抗体只识别甲基化胞嘧啶,不管DNA序列如何,保证了所有序列区间的甲基化胞嘧啶检测。这意味着和使用甲基结合蛋白(MBD)亲和富集的方法只识别CpG甲基化不同,MeDIP方法即使甲基化不发生在CpG双核苷酸序列区间也可以富集到。

MeDIP 试剂盒优势

  • 仅富集5-mC甲基化DNA的特异性抗体
  • 桥连抗体有助于提高DNA富集效率
  • 一步法免疫沉淀反应
  • 无需预洗磁珠
  • 经过优化的使用磁珠的方案可以减少手动操作时间
  • 试剂盒包含人类基因组DNA及PCR引物作为阳性对照验证富集效率

MeDIP方法的流程图

Flow chart of the MeDIP method.
图1:MeDIP方法的流程图

含有5-甲基化胞嘧啶的片段化的基因组单链DNA能够被特异性5-mC单抗结合桥连抗体和磁珠富集出来,富集的DNA经过过夜孵育从磁珠洗脱。

MeDIP 样本富集后NGS测序的样本制备

由于MeDIP试剂盒使用5-mC甲基化抗体只会特异性结合含有甲基化胞嘧啶的单链DNA , 所以DNA样本必须在免疫沉淀前做变性处理。变性的结果是富集的DNA样本无法使用一些常规的NGS建库方法,因为接头需要连接双链DNA。

这个问题可以通过两种方法解决,一种是MeDIP沉淀前在片段化处理的基因组DNA样本中加入NGS接头,另一种是使用与ssDNA兼容的其他建库方案。

如果您希望使用Active motif MeDIP试剂盒结合NGS测序分析,我们建议使用Swift Biosciences公司的Accel-NGS® 1S DNA Library Kits,具体操作请参考说明书

 

MeDIP 试剂盒组分

MeDIP试剂盒包含5-mC小鼠单抗,桥连抗体,小鼠IgG阴性对照,PIC,buffer C, buffer D,洗脱buffer AM2, 中和buffer,无菌水,PCR管,protein G磁珠,以及用于分离和洗脱5-mC甲基化DNA片段的磁条。

操作手册提供DNA样本片段化处理到定量PCR扩增目的位点的所有实验步骤。

试剂盒包含阳性对照DNA(MseI酶切的人类基因组DNA)和阳性对照PCR引物ZC3H13

试剂盒的所有组分保存温度从室温到-20°C。请参考说明书查询各组分的正确保存温度。

 

MeDIP试剂盒数据

MeDIP试剂盒可以从基因组DNA片段中选择性富集富含5-mC的甲基化DNA片段。使用500ng 试剂盒包含的MseI酶切人类基因组DNA样本,在使用和不使用桥连抗体的情况下测试MeDIP试剂盒。洗脱后DNA用 Chromatin IP DNA Purification Kit(Catalog No. 58002) 进行纯化,并用阳性引物 ZC3H13进行定量PCR检测。图2中结果表明配合使用桥连抗体效果更好。图3中富集后DNA使用阳性对照ZC3H13 PCR引物或阴性对照GAPDH PCR引物检测。

Bridging antibody effects with MeDIP Kit
图2 MeDIP试剂盒使用和不使用桥连抗体的检测结果

MseI酶切人类基因组DNA(500ng)使用MeDIP试剂盒5-mC单抗或小鼠IgG,在使用和不使用桥连抗体情况下进行检测。洗脱DNA样本经纯化后使用ZC3H13引物定量PCR分析。实验发现,使用5-mC单抗配合桥连抗体能够特异性的富集甲基化DNA,小鼠IgG或者不配合桥连抗体都没有富集效果。实验中使用的ZC3H13位点在人类基因组DNA确定会发生甲基化,因此一定会有效扩增。显示的数据为样本重复2次实验结果。

MeDIP real time PCR results with ZC3H13 and GAPDH primer sets
图3:使用ZC3H13GAPDH引物的定量PCR结果

MseI酶切人类基因组DNA(500ng)使用MeDIP试剂盒5-mC单抗或小鼠IgG进行检测。洗脱后DNA用 Chromatin IP DNA Purification Kit (Catalog No. 58002) 进行纯化,并用阳性 ZC3H13 PCR引物和阴性GAPDH PCR引物定量PCR。结果发现ZC3H13位点DNA甲基化有富集,GAPDH位点及使用小鼠IgG抗体组没有富集。显示的数据为样本重复2次实验结果。

Next-Gen sequencing data generated using Active Motif’s MeDIP kit correlates well with CpG density
图4:Active Motif MeDIP试剂盒NGS测序产生结果与CpG密集度正相关性

使用Active Motif MeDIP试剂盒从1ug连接接头的人源PBMC样本富集DNA,后用Illumina测序平台进行NGS测序产生2600万个序列标签。这些标签比对到基因组生成全基因组DNA甲基化图谱。以上图片显示了富集区间(紫色peaks)与CpG密集度(棕褐色)呈现正相关。

Next-Gen sequencing data generated using Active Motif’s MeDIP kit detects methylation at CpG shores
图5:Active Motif MeDIP试剂盒检测CpG shores甲基化的NGS测序数据

使用Active Motif MeDIP试剂盒从1ug连接接头的人源PBMC样本富集DNA,后用Illumina测序平台进行NGS测序产生2600万个序列标签。这些标签比对到基因组生成全基因组DNA甲基化图谱。以上图片显示了CpG Shores而非CpG岛本身检测到的DNA甲基化的2个例子。数据与大部分甲基化发生在CpG岛临近区间这一最新研究成果相吻合。

 

MeDIP试剂盒发表文献

如下是选取的使用Active Motif MeDIP试剂盒的发表文献:

 

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